ГОСТ EN 15607-2015

ГОСТ EN 15607-2015

     

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Определение D-биотина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Foodstuffs. Determination of D-biotin by high performance liquid chromatography

МКС 67.040

Дата введения 2017-01-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Открытым акционерным обществом "Всероссийский научно-исследовательский институт сертификации" на основе собственного перевода на русский язык европейского стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 29 мая 2015 г. N 77)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 21 июля 2015 г. N 949-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 15607-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.

5 Настоящий стандарт идентичен европейскому стандарту EN 15607:2009* "Продукты пищевые. Определение D-биотина высокоэффективной жидкостной хроматографией" ("Foodstuffs - Determination of D-biotin by HPLC", IDT)

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Европейский региональный стандарт разработан Техническим комитетом CEN/TC 275 "Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы", секретариатом которого является DIN (Германия).

Сведения о соответствии ссылочных европейских стандартов межгосударственным стандартам приведены в дополнительном приложении ДА

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

7 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Ноябрь 2019 г.

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

     1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения содержания D-биотина в пищевых продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Метод прошел валидацию при межлабораторных сравнительных испытаниях с использованием как обогащенных проб, так и проб с естественным содержанием D-биотина, а именно концентратов типа сухого завтрака - мюсли, сухого молока для грудных детей, лиофилизированных зеленых овощей с ветчиной, лиофилизированного куриного бульона и обогащенного апельсинового сока в диапазоне значений содержания D-биотина от 16 до 200 мкг/100 г (см. приложение В).

Примечания

1 Настоящим методом может также определяться D-биоцитин, хотя ни в одной из проб, использовавшихся при межлабораторных сравнительных испытаниях, D-биоцитин не содержался. Тем не менее открываемость как D-биотина, так и D-биоцитина превышает 90% (см. [2] и [3]).

2 При анализе проб, содержащих куриные яйца, метод приводит к заниженным значениям содержания D-биотина.

     2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использована нормативная ссылка на следующий стандарт. Для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных - последнее издание (включая все изменения).

EN ISO 3696, Water for analytical laboratory use - Specification and test methods (ISO 3696:1987) (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

     3 Сущность метода

Метод основан на выделении D-биотина из проб пищевых продуктов обработкой ферментами и количественном определении методом ВЭЖХ с послеколоночной дериватизацией ([2], [3]).

Комплексообразование D-биотина с белком авидином является весьма специфическим. Поэтому авидин, ковалентно связанный с флуоресцентной меткой - флуоресцеин-5-изотиоцианитом, используется в качестве реагента для послеколоночной дериватизации D-биотина ([4], [5]).

     4 Реактивы

4.1 Общие положения

Если не указано иное, то при анализе используют только реактивы гарантированной чистоты и воду, по крайней мере степени чистоты 1 по EN ISO 3696 или повторно перегнанную дистиллированную воду.

4.2 Требования к химическим реактивам и приготовление растворов

4.2.1 Метанол для ВЭЖХ, массовая доля основного вещества w() не менее 99,8%.

4.2.2 Раствор серной кислоты молярной концентрации c()=1 моль/дм.

4.2.3 Раствор серной кислоты молярной концентрации c()=1,5 моль/дм.

4.2.4 Лимонная кислота моногидрат, массовая доля основного вещества w() не менее 99,7%.

4.2.5 Гидрофосфат натрия 2-водный, массовая доля основного вещества w() не менее 99,8%.

4.2.6 Глутатион, массовая доля основного вещества w() не менее 98%.

4.2.7 Этилендиаминтетраацетат натрия (ЭДТА) 2-водный, массовая доля основного вещества w() не менее 99%.

4.2.8 Гидрофосфат калия, массовая доля основного вещества w() не менее 96%.

4.2.9 Дигидрофосфат калия, массовая доля основного вещества w() не менее 99,5%.

4.2.10 Приготовление цитратного буферного раствора

0,462 г моногидрата лимонной кислоты (4.2.4) и 1,05 г гидрофосфата натрия 2-водного (4.2.5) растворяют в 450 см дистиллированной воды. Устанавливают значение рН раствора, равное 5,7, при помощи раствора серной кислоты (4.2.3) и затем разбавляют раствор до объема 500 см.

Срок хранения раствора - 1 день.

4.2.11 Приготовление раствора глутатиона массовой концентрации ()=10 г/дм

30 мг глутатиона (4.2.6) растворяют в 3 см дистиллированной воды.

Срок хранения раствора - 1 день.

4.2.12 Приготовление раствора ЭДТА массовой концентрации ()=10 г/дм

0,1 г ЭДТА (4.2.7) растворяют в 10 см дистиллированной воды.

Срок хранения раствора - 1 день.

4.2.13 Приготовление раствора гидрофосфата калия молярной концентрации с()=0,1 моль/дм

17,4 г гидрофосфата калия (4.2.8) растворяют в 1000 см воды.

Срок хранения раствора - 2 дня.

4.2.14 Приготовление раствора дигидрофосфата калия молярной концентрации с()=0,1 моль/дм

13,6 г дигидрофосфата калия (4.2.9) растворяют в 1000 см воды.

Срок хранения раствора - 2 дня.

4.2.15 Приготовление фосфатного буферного раствора с рН 6,0

Растворы гидрофосфата калия (4.2.13) и дигидрофосфата калия (4.2.14) смешивают в такой пропорции, чтобы значение рН приготовленного раствора составляло 6,0 (например, 30 объемных частей раствора по 4.2.13 и 70 объемных частей раствора по 4.2.14).

Срок хранения раствора - 7 дней при комнатной температуре.

4.2.16 Приготовление фосфатного буферного раствора с рН 7,0

Растворы гидрофосфата калия (4.2.13) и дигидрофосфата калия (4.2.14) смешивают в такой пропорции, чтобы значение рН приготовленного раствора составляло 7,0 (например, 40 объемных частей раствора по 4.2.13 и 60 объемных частей раствора по 4.2.14).

Срок хранения раствора - 7 дней при комнатной температуре.

4.2.17 Папаин порошкообразный (CAS 9001-73-4) с удельной каталитической активностью 15 нкат/мг по отношению к этиловому эфиру N-бензоил-L-аргинина (ВАЕЕ) при рН 6,2 и 25°С. Удельная каталитическая активность 15 нкат/мг соответствует 1 МЕ/мг (ME - международная единица каталитической активности).

________________

Катал (кат) является производной единицей системы СИ для каталитической активности. 1 катал - это такая каталитическая активность, при которой скорость реакции при заданных условиях увеличивается на 1 моль/с.

4.2.18 Раствор папаина массовой концентрации 20 г/дм

4.2.18.1 Приготовление раствора

1 г порошкообразного папаина (4.2.17) растворяют в 50 см цитратного буферного раствора (4.2.10). Срок хранения раствора - 5 дней при 4°С.

4.2.18.2 Проверка активности папаина

Активность папаина может быть проверена путем приготовления второго экстракта (6.2) с удвоенным количеством фермента. Найденное содержание биотина должно соответствовать расчетному значению и ни в коем случае не превышать его.

Примечание - При межлабораторных сравнительных испытаниях был использован порошкообразный папаин, поставщиком которого была компания VWR International GmbH, 20а, 64295 Darmstadt, Ref.-Nr 26.146.180t.

________________

Эта информация приведена исключительно для удобства пользователя настоящего стандарта и не является поддержкой указанного поставщика. Могут быть использованы аналогичные продукты, если доказано, что их применение приводит к идентичным результатам.

4.2.19 Конъюгат Авидин - флуоресцеинизотиоцианат (Avidin-FITC), содержащий 80% протеина (от 2 до 4 моль флуоресцеинизотиоцианата на каждый моль авидина).

4.2.20 Исходный раствор для послеколоночной дериватизации массовой концентрации (Avidin-FITC)=50 мг/см

2,5 мг конъюгата авидин - флуоресцеинизотиоцианат (4.2.19) растворяют в 50 см фосфатного буферного раствора с рН 7,0 (4.2.16). Срок хранения раствора - 14 дней при 4°С.

4.2.21 Рабочий раствор для послеколоночной дериватизации массовой концентрации (Avidin-FITC)=2 мг/см

25 см исходного раствора для послеколоночной дериватизации (4.2.20) смешивают с 600 см фосфатного буферного раствора с рН 7,0 (4.2.16). Полученный раствор фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм (5.5). Раствор устойчив при хранении в темноте в течение 8 ч.

4.2.22 Подвижная фаза для ВЭЖХ

80 объемных частей фосфатного буферного раствора с рН 6,0 (4.2.15) смешивают с 20 объемными частями метанола (4.2.1) и фильтруют через фильтр с размером пор 0,45 мкм (5.5).

4.2.23 Така-диастаза, выделенная из Aspergillus Oryzae, удельная каталитическая активность 1500 нкат/мг (соответствует 100 МЕ/мг), для проб с высоким содержанием крахмала.

4.3 Образцы сравнения

4.3.1 Общие положения

D-биотин и D-биоцитин могут быть приобретены у разных поставщиков. Необходимо убедиться в том, что пики D-биотина и D-биоцитина разделяются до базовой линии на хроматограмме раствора их смеси. Массовая доля основного вещества в образце сравнения биотина может быть установлена в соответствии с методом Европейской фармакопеи [6].

4.3.2 D-Биотин, массовая доля основного вещества w() не менее 99%

4.3.3 D-Биоцитин, массовая доля основного вещества w() не менее 98%

4.4 Исходные растворы

4.4.1 Приготовление исходного раствора D-биотина массовой концентрации ()=100 мкг/см

Приблизительно 10 мг образца сравнения D-биотина (4.3.2), взвешенного с погрешностью ±0,1 мг, растворяют в 100 см дистиллированной воды. Растворение может продолжаться от 4 до 5 ч. Срок хранения раствора - 2 мес при минус 18°С.

4.4.2 Приготовление исходного раствора D-биоцитина массовой концентрации ()=100 мкг/см

Приблизительно 10 мг образца сравнения D-биоцитина (4.3.3), взвешенного с погрешностью ±0,1 мг, растворяют в 100 см дистиллированной воды. Срок хранения раствора - 2 мес при минус 18°С.

4.5 Стандартные растворы

4.5.1 Стандартные растворы D-биотина массовой концентрации () от 0,05 до 0,30 мкг/см

Приготавливают промежуточный раствор D-биотина путем разбавления 1 см исходного раствора (4.4.1) до 10 см дистиллированной водой. Затем готовят шесть градуировочных растворов, разбавляя 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 и 3,0 см промежуточного раствора до 100 см дистиллированной водой. Срок хранения растворов - 1 день.

4.5.2 Стандартный раствор D-биоцитина массовой концентрации ()=0,30 мкг/см

Приготавливают промежуточный раствор путем разбавления 1 см исходного раствора (4.4.2) до 10 см дистиллированной водой. Затем 3,0 см промежуточного раствора разбавляют до 100 см дистиллированной водой. Срок хранения раствора - 1 день.

     5 Аппаратура

5.1 Общие положения

При проведении испытания используют обычное лабораторное оборудование, в частности следующее.

5.2 Термостат, поддерживающий температуру на уровне (37±2)°С.

5.3 Система для ВЭЖХ, состоящая из насоса, устройства для ввода проб, флуориметрического детектора, позволяющего проводить измерения при длине волны возбуждения 490 нм и длине волны регистрации 520 нм, и системы для сбора и обработки данных, например интегратора.

5.4 Обращенно-фазовые аналитические колонки, например LiChrosper 100 RP-18 endcapped

________________

Эта информация приведена только для удобства пользователя настоящего стандарта и не означает поддержки этих продуктов. Допускается использование аналогичных продуктов, если доказано, что их использование приводит к аналогичному результату.

Приведенные ниже характеристики аналитической колонки обеспечивают разделение пиков аналитов до базовой линии:

a) длина колонки 250 мм;

b) внутренний диаметр 4,0 мм;

c) размер частиц 5 мкм.

Допускается использовать колонки иных размеров и с иным размером частиц. При этом параметры разделения на таких колонках должны быть проверены с тем, чтобы гарантировать получение сопоставимых результатов. Критерием эффективности подходящих аналитических колонок является разделение пиков аналитов до базовой линии.

5.5 Устройства для фильтрования

Устройства для фильтрования подвижной фазы большого и малого размера, снабженные, например, фильтрами с размером пор 0,45 мкм.

Примечание - Фильтрование подвижной фазы и растворов проб через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм перед применением или инжектированием продлевает срок жизни колонок.

5.6 Послеколоночный реактор, состоящий из системы для ввода реагента, например Т-образногосмесителя со следующим за ним капиллярным реактором длиной 10 м, выполненным из политетра-фторэтиленовой трубки внутреннего диаметра 0,5 мм, смотанной по спирали диаметром 14 мм, изготовленной, например, по [7] (модель KOT2). Капиллярные реакторы могут быть приобретены у компаний "Супелко" или MicroSolv Tech.

________________

Эта информация приведена только для удобства пользователя настоящего стандарта и не означает поддержки этих продуктов. Допускается использование аналогичных продуктов, если доказано, что их использование приводит к аналогичному результату.

     6 Проведение испытаний

6.1 Подготовка испытуемой пробы

Испытуемую пробу гомогенизируют. Грубые материалы размалывают в подходящей мельнице и тщательно перемешивают. Чтобы исключить длительное воздействие высоких температур, пробу предварительно охлаждают.

6.2 Экстракция

Пробу массой от 0,5 до 10 г (что приблизительно соответствует содержанию D-биотина от 2 до 15 мкг) взвешивают с точностью до 1 мг и помещают в колбу Эрленмейера. К пробе добавляют 300 мм раствора глутатиона (4.2.11), 300 мм раствора ЭДТА (4.2.12), 30 см цитратного буферного раствора (4.2.10) и 3 см раствора папаина (4.2.18). При высоком содержании крахмала добавляют 100 мг така-диатазы (4.2.23). Смесь выдерживают в течение ночи в термостате при 37°С при постоянном перемешивании. После охлаждения раствор переносят в мерную колбу вместимостью 50 см и разбавляют дистиллированной водой до метки. Раствор перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр. Перед вводом в хроматограф его фильтруют еще раз через фильтр с размером пор 0,45 мкм (5.5).

Примечание - Фильтрование как подвижной фазы, так и растворов проб через мембранный фильтр с* перед применением или вводом в хроматограф продлевает срок службы колонок.

________________

* Текст документа соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.

6.3 Проведение хроматографического анализа

Дозируют в ВЭЖХ-систему равные объемы градуировочных растворов и растворов проб. D-биотин идентифицируют путем сравнения времен удерживания пика на хроматограмме раствора пробы и градуировочных растворов. Идентификацию пиков можно также осуществить при помощи добавки образца сравнения к раствору пробы.

Из-за ограниченной стабильности раствора для послеколоночной дериватизации (4.2.21) ее регулярно проверяют при проведении серии измерений путем ввода градуировочного раствора. Приведенные ниже условия обеспечивают разделение и количественное определение D-биотина:

- хроматографическая колонка: LiChrospher 100 RP-18 endcapped, 5 мкм, 2504,0 мм;

- подвижная фаза: 80 объемных частей фосфатного буферного раствора с рН 6 (4.2.15) и 20 объемных частей метанола (4.2.1);

- расход подвижной фазы: 0,4 см/мин;

- объем инжектирования: 30 мм;

- флуоресцентное детектирование: длина волны возбуждения 490 нм, длина волны регистрации 520 нм;

- расход реагента для послеколоночной дериватизации: 1 см/мин.

Примечание - Этот метод может быть также использован для оценки содержания D-биоцитина.

     7 Обработка результатов

При использовании метода внешнего стандарта определяют площади или высоты пиков и затем устанавливают градуировочную характеристику, аппроксимируемую уравнением второго порядка.

Содержание D-биотина, w, мкг/100 г пробы, вычисляют по формуле (1)

,                                                          (1)

где - массовая концентрация D-биотина в растворе пробы (6.2), мкг/см, вычисленная при помощи градуировочной характеристики;

- объем раствора пробы (6.2), см;

- масса пробы, г;

100 - множитель для пересчета содержания D-биотина к 100 г пробы.

     8 Прецизионность

8.1 Общие положения

Данные по прецизионности хроматографического метода определения D-биотина были получены согласно ИСО 5725-2 [1] в 2000 г. в ходе межлабораторных сравнительных испытаний, организованных Генеральной комиссией по унификации методов анализа, Франция [3]. Все участники межлабораторных испытаний использовали градуировочные характеристики, установленные по трем точкам.

Полученные статистические данные приведены в приложении В.

8.2 Предел повторяемости

Абсолютная разность между двумя единичными результатами испытаний, полученными одним исполнителем на идентичном исследуемом материале на одном и том же оборудовании в течение возможно короткого промежутка времени, может превышать предел повторяемости r не чаще, чем в 5% случаев. Значения для D-биотина приведены ниже:

8.3 Предел воспроизводимости

Абсолютная разность между двумя единичными результатами, полученными в двух лабораториях на идентичном исследуемом материале, может превышать предел воспроизводимости R не чаще, чем в 5% случаев. Значения приведены ниже:

     9 Протокол испытаний

Протокол испытаний должен содержать по меньшей мере следующие сведения:

a) всю информацию, необходимую для идентификации пробы;

b) ссылку на настоящий стандарт или используемый метод;

c) результаты испытаний с указанием единиц измерений, в которых результат испытаний выражен;

d) дату и способ отбора проб (если он известен);

e) дату поступления пробы;

f) дату проведения испытаний;

g) все особенности, наблюдавшиеся при проведении испытаний;

h) любые применявшиеся операции, не оговоренные в методе или рассматриваемые как необязательные, которые могли повлиять на результат испытаний.

Приложение А
(справочное)

     
Примеры хроматограмм

X - время, мин; Y - интенсивность флуоресценции; 1 - D-биотин; 2 - D-биоцитин

Рисунок А.1 - Пример хроматографического разделения D-биотина и D-биоцитина в градуировочном растворе

Условия анализа:

Хроматографическая колонка: LiChrospher 100 RP-18 endcapped, 5 мкм, 250 мм · 4,0 мм;

Подвижная фаза: смесь восьми объемных частей фосфатного буферного раствора с рН 6 (4.2.15) и двух объемных частей метанола (4.2.1);

Расход подвижной фазы: 0,4 см/мин;

Объем инжектирования: 30 мм;

Флуоресцентное детектирование: возбуждение при 490 нм, регистрация при 520 нм;

Расход реагента для послеколоночной дериватизации: 1,0 см/мин.

X - время, мин; Y - интенсивность флуоресценции; 1 - D-биотин

Рисунок А.2 - Пример хроматограммы D-биотина в пробе питания для грудных детей (сухое молоко)

Условия анализа:

Хроматографическая колонка: LiChrospher 100 RP-18 endcapped, 5 мкм, 250 мм · 4,0 мм;

Подвижная фаза: смесь восьми объемных частей фосфатного буферного раствора с рН 6 (4.2.15) и двух объемных частей метанола (4.2.1);

Расход подвижной фазы: 0,4 см/мин;

Объем инжектирования: 30 мм;

Флуоресцентное детектирование: возбуждение при 490 нм, регистрация при 520 нм;

Расход реагента для послеколоночной дериватизации: 1,0 см/мин.

Приложение B
(справочное)

     
Данные по прецизионности

Значения, приведенные в таблице В.1, были получены при межлабораторных сравнительных испытаниях, организованных в 2000 г. Генеральной комиссией по унификации методов анализа, Франция [3], [8]. Эти испытания были проведены в соответствии со стандартом ИСО 5725-2 [1]. Все участники межлабораторных испытаний использовали градуировочные характеристики, установленные по трем точкам.

Таблица В.1 - Данные по прецизионности для проб мюсли, питания для грудных детей (сухое молоко), витаминизированного апельсинового сока, лиофилизированного пюре (зеленые овощи с ветчиной) и лиофилизированного куриного бульона

Приложение ДА
(справочное)

     Сведения о соответствии ссылочных европейских стандартов межгосударственным стандартам

Таблица ДА.1

Библиография