ГОСТ EN 12823-2-2014

ГОСТ EN 12823-2-2014

     

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

Определение содержания витамина А методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Часть 2

Измерение содержания бета-каротина

Foodstuffs. Determination of vitamin A by high performance liquid chromatography. Part 2. Measurement of -carotene

МКС 67.050

Дата введения 2017-07-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Республиканским государственным предприятием "Казахстанский институт стандартизации и сертификации" Комитета технического регулирования и метрологии и Техническим комитетом по стандартизации ТК 71 "Экологическая безопасность сырья, материалов, веществ и сооружений" на основе собственного перевода немецкоязычной версии стандарта, указанного в пункте 5

2 ВНЕСЕН Комитетом технического регулирования и метрологии Министерства индустрии и новых технологий Республики Казахстан

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 июня 2014 г. N 45)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 5 мая 2016 г. N 289-ст межгосударственный стандарт ГОСТ EN 12823-2-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2017 г.

5 Настоящий стандарт идентичен европейскому стандарту EN 12823-2:2000* "Продукты пищевые. Определение содержания витамина А методом жидкостной хроматографии высокого разрешения. Часть 2. Измерение содержания бета-каротина" ("Foodstuffs - Determination of vitamin A by high performance liquid chromatography - Part 2: Measurement of (-carotene", IDT).

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Европейский стандарт EN 12823-2:2000 подготовлен Техническим комитетом CEN/ТС 275 "Анализ пищевых продуктов. Горизонтальные методы" Европейского комитета по стандартизации (CEN).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать вместо ссылочных международных и европейских стандартов соответствующие им межгосударственные стандарты, сведения о которых приведены в дополнительном приложении ДА

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

7 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Ноябрь 2019 г.

          Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.

В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

     1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает метод определения полного -каротина в пищевых продуктах при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее - ВЭЖХ).

     2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты. Для датированных ссылок применяют только указанное издание ссылочного стандарта, для недатированных - последнее издание (включая все изменения).

EN ISO 3696, Water for analytical laboratory use. Specification and test methods (Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний)

ISO 5555, Animal and vegetable fats and oils. Sampling (Масла и жиры животные и растительные. Отбор проб)

EN 12823-1:2000, Foodstuffs. Determination of vitamin A by high performance liquid chromatography. Measurement of all-trans-retinol and 13-cis-retinol (Продукты питания. Определение содержания витамина А методом жидкостной хроматографии высокого разрешения. Часть 1. Измерение содержания полного транс-ретинола и 13-цис-ретинола)

     3 Сущность метода

Сумму изомеров -каротина в испытуемом растворе пробы определяют методом ВЭЖХ с помощью спектрофотометрического детектора в видимом диапазоне. Экстракт, полученный после омыления, описанного в EN 12823-1, может использоваться для количественного анализа. Информация по идентификации на основании времени удерживания и определению по площади или высоте пиков указана в [3], [7].

Может быть также использован метод внутреннего стандарта, если соответствующие проверки полноты обнаружения подтверждают, что поведение внутреннего стандарта и аналита тождественно.

     4 Реактивы

Для испытаний используют реактивы гарантированной чистоты и воду не ниже 1-й степени чистоты в соответствии с EN ISO 3696.

4.1 Метанол.

4.2 Этанол абсолютный, объемной долей 100%.

4.3 Этанол, объемной долей 96%.

4.4 Сульфат натрия (сернокислый натрий) безводный.

4.5 Растворы гидроксида калия (KOH) для омыления с соответствующими массовыми концентрациями, например: KOH = 50 г/100 см или 60 г/100 см, или спиртовые растворы, например: 28 г KOH в 100 см смеси этанол/вода (в объемном соотношении 9:1).

4.6 Антиоксиданты: аскорбиновая кислота (АК), аскорбат натрия, сульфид натрия (), бутилгидрокситолуол, пирогаллол или гидрохинон.

4.7 Растворители и экстрагенты: ацетонитрил, диэтиловый эфир (без пероксидов), диизопропиловый эфир, петролейный эфир (кипящий при температуре от 40°С до 60°С), н-гексан, дихлорметан, тетрагидрофуран, толуол или их смеси.

4.8 Раствор ацетата аммония в метаноле, например, c()=0,05 моль/дм.

4.9 Триэтиламин.

4.10 Растворители, выполняющие роль подвижной фазы в ВЭЖХ, например, смесь ацетонитрил (см. 4.7) - метанольный раствор ацетата аммония (см. 4.8) - дихлорметан (см. 4.7) (75:20:5 в объемном соотношении), содержащий 0,1% (по массе) бутилгидрокситолуола (см. 4.6) и 0,05% (по массе) триэтиламина (см. 4.9). Информация о подвижных фазах для альтернативных систем ВЭЖХ приведена в приложении С.

4.11 Образцы сравнения

4.11.1 Общие положения

Чистота образцов сравнения -каротина и -каротина варьируется между 90% и 100%. Поэтому необходимо определить массовую концентрацию градуировочного раствора спектрофотометрическим методом (см. 4.12.2).

4.11.2 -каротин, М () = 536,85 г/моль, с массовой долей -каротина не менее 95%.

4.11.3 -каротин, М () = 536,85 г/моль, для качественного анализа.

4.11.4 Ликопин, М () = 536,85 г/моль, для качественного анализа.

4.12 Приготовление исходного раствора

4.12.1 Исходный раствор -каротина

Растворяют 3 мг образца сравнения -каротина (см. 4.11.2) в 20 смдихлорметана, тетрагидрофурана или толуола (см. 4.7), помещая мерную колбу на 30 с в ультразвуковую баню (см. 5.6).

Разбавляют этот раствор н-гексаном до объема 100 см.

Разбавляют 10,0 см полученного раствора н-гексаном до 100 см.

1 см этого раствора содержит 3 мкг -каротина в смеси н-гексан/дихлорметан (98:2) (по объему), смеси н-гексан/тетрагидрофуран (98:2) (в объемном соотношении) или н-гексан/толуол (98:2) (в объемном соотношении).

Хранят исходный раствор в защищенном от света месте при температуре ниже 4°С.

4.12.2 Проверка концентрации и чистоты

Измеряют оптическую плотность исходного раствора -каротина (см. 4.12.1) при длине волны 453 нм на спектрофотометре (см. 5.1). Вычисляют массовую концентрацию , мкг/см, по формуле

,                                                     (1)

где - оптическая плотность исходного раствора при максимальной длине волны 453 нм;

2592 - значение коэффициента экстинкции Е для раствора -каротина в н-гексане. Оно может значительно отличаться для других растворителей [8].

Соотношение должно быть больше 15, а соотношение должно находиться в диапазоне от 1,14 до 1,18 для чистого полного транс--каротина [8].

4.12.3 Стандартный раствор -каротина

Пипеткой отмеряют 20 см исходного раствора -каротина (см. 4.12.1) в круглодонную колбу и удаляют растворитель в условиях пониженного давления (см. 5.2) при температуре не выше 50°С. Растворяют полученный осадок в 20 см растворителя, совместимого с обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Стандартный раствор хранят в защищенном от света месте при температуре ниже 4°С. Раствор стабилен в течение одной недели.

4.12.4 Стандартные растворы -каротина и ликопина

_______________

Данные стандартные растворы -каротина и ликопина не обязательны для количественного определения -каротина в экстракте пробы, но способствуют четкой идентификации различных соединений.

Для качественного анализа растворяют 0,3 мг -каротина (см. 4.11.3) или ликопина (см. 4.11.4) в 10 см тетрагидрофурана (см. 4.7) и разбавляют в этаноле до объема 100 см (см. 4.3) или другом растворителе, совместимым с обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Стандартный раствор хранят в защищенном от света месте при температуре ниже 4°С. Раствор стабилен в течение одной недели.

     5 Оборудование

Используется стандартное лабораторное оборудование, а также следующее:

5.1 Спектрофотометр УФ и видимой области спектра, способный измерять оптическую плотность на указанных длинах волн, с соответствующими кварцевыми кюветами, например с толщиной слоя 1 см.

5.2 Испаритель ротационный с водяной баней и вакуумным насосом.

Примечание - Для сброса вакуума рекомендуется использовать азот.

5.3 Система ВЭЖХ, состоящая из насоса, устройства для ввода проб, спектрофотометрического детектора для ультрафиолетовой и видимой области и системы регистрации и обработки, например интегратора.

5.4 Колонки ВЭЖХ

Аналитическая колонка для обращенно-фазовой хроматографии, например  С18, с размером частиц неподвижной фазы 5 мкм, диаметром от 4,0 до 4,6 мм, длиной 250 мм.

Могут использоваться другие типы колонок и размеры частиц наполнителя (адсорбента), отличных от указанных в настоящем стандарте. Для получения аналогичных результатов может потребоваться корректировка условий проведения хроматографических измерений для таких колонок.

Показателем эффективности для соответствующих аналитических колонок является степень разделения для пиков полного транс--каротина и полного транс--каротина, которая должна быть более 1.

Подходящими аналитическими колонками с обращенной фазой являются, например, Vydac®201TP54, Vydac®218TP54, Eurospher®100-C18, Ultrasper®ODS, Spherisorb®ODS2, Zorbax®ODS и LiChrospher®RP18. Колонки могут использоваться с последовательным включением. Также рекомендуется использовать защитную колонку для продления срока службы аналитической колонки.

_______________

Vydac®201TP54, Vydac®218TP54, Eurospher®100-C18, Ultrasper®ODS, Spherisorb®ODS2, Zorbax®ODS и LiChrospher®RP18 - это примеры подходящей продукции, имеющиеся в продаже. Данная информация приведена для удобства пользователей данного стандартного метода и не является поддержкой названной продукции.

5.5 Фильтр

Мембранные фильтры большого и малого размера для фильтрации подвижных фаз ВЭЖХ и растворов проб, например с размером пор 0,45 мкм.

Примечание - Фильтрация подвижной фазы и растворов испытуемых проб через мембранный фильтр перед использованием или вводом увеличивает срок службы колонок.

5.6 Ультразвуковая баня.

5.7 Фильтры для разделения фаз (применяются по выбору пользователя стандарта).

     6 Отбор проб

Отбор проб - по ISO 5555.

     7 Порядок проведения испытания

7.1 Подготовка пробы для испытания

Пробу перед испытанием гомогенизируют. Крупнозернистый материал перемалывают с помощью соответствующего измельчителя и тщательно перемешивают. Для того, чтобы исключить длительное воздействие высоких температур, пробу охлаждают.

-каротин чувствителен к ультрафиолетовому излучению и свету.

7.2 Подготовка раствора пробы

7.2.1 Омыление

От 2 до 10 г испытуемой пробы омыляют с обратным холодильником, предпочтительно в атмосфере азота, с использованием соответствующих количеств метанола (см. 4.1) или этанола (см. 4.3), воды, антиоксидантов (см. 4.6) и одного из растворов гидрооксида калия (см. 4.5.1). Добавляют антиоксиданты к пробе до добавления раствора гидрооксида калия. Также может быть добавлен сульфид натрия (см. 4.6) для устранения окислительных каталитических эффектов остаточных количеств металлов.

Примеры соответствующих соотношений реактивов указаны в таблице 1.

Таблица 1 - Соотношение реактивов для омыления

Время омыления составляет от 15 до 40 мин при температуре от 80°С до 100°С.

Если после окончания омыления на поверхности охлажденной реакционной смеси присутствует жир или масло, то омыление продолжают после добавления дополнительного количества водноэтанольного раствора гидроксида калия.

Примечание - Установлено, что при испытаниях проб с низким содержанием жира, таких, как фрукты или овощи, допускается проводить экстракцию соответствующим растворителем без предварительного омыления (см. [9]-[11]). Однако в этом случае рекомендуется проверять соблюдение приведенных выше требований к эффективности хроматографического разделения (см. 5.4) из-за возможного мешающего влияния других компонентов пробы.

7.2.2 Экстракция

Во избежание образования эмульсии к раствору омыленной пробы добавляют такое количество воды, чтобы объемное соотношение спирта и воды в полученном растворе составило 1:1.

Экстракцию -каротина из раствора омыленной пробы проводят с помощью соответствующего растворителя или смеси растворителей (см. 4.7), повторяя процедуру три-четыре раза с объемами от 50 до 150 см. Объединенный экстракт промывают водой до нейтральной среды (от 2 до 4 раз, от 50 до 150 см).

7.2.3 Выпаривание

Экстракт выпаривают, используя ротационный испаритель (см. 5.2) при пониженном давлении и температуре не выше 50°С. Остатки воды удаляют высушиванием над сульфатом натрия или способом азеотропной перегонки с этанолом (см. 4.2) или толуолом (см. 4.6). Другие равноценные способы, такие как использование фильтровальной бумаги для разделения фаз (см. 5.7) для удаления остатков воды используют при условии, что они не влияют на результат испытаний.

7.2.4 Приготовление раствора для хроматографического анализа

Остаток растворяют в той же смеси растворителей, в которой были приготовлены стандартные растворы (см. 4.12.3 и 4.12.4), предпочтительно в подвижной фазе (см. 4.8) или в другом растворителе, совместимом с подвижной фазой для ВЭЖХ таким образом, чтобы получить массовую концентрацию -каротина вплоть до 5 мкг/см. Полученный раствор используют для хроматографического анализа.

7.3 Идентификация

Идентификацию -каротина проводят путем сравнения времени удерживания индивидуальных пиков на хроматограммах раствора испытуемой пробы (см. 7.2.4) и стандартного раствора (см. 4.12.3 и 4.12.4). Идентификация пиков также возможна путем добавления небольшого количества соответствующих стандартных образцов в раствор испытуемой пробы.

Примечание - Разделение и количественный анализ является удовлетворительным при соблюдении следующих хроматографических условий (в соответствии с рисунком А.1).

_______________

Spherisorb® - это продукт, поставляемый PhaseSeparationsInc; Vydac® - это продукт, поставляемый TheSeparationsGroup. Данная информация приведена только для удобства пользователей этого стандартного метода и не является рекламированием указанных продуктов. Могут использоваться эквивалентные продукты, если они дают аналогичные результаты.

7.4 Определение

Соответствующие объемы (например, 20 мм) стандартного раствора (см. 4.12.3) и раствора испытуемой пробы (см. 7.2.4) вводят в систему ВЭЖХ (см. 5.3). Для количественного определения методом внешнего стандарта определяют площадь или высоту пика и сравнивают результаты с соответствующими значениями стандартного вещества с ближайшей площадью/высотой пика или используют градуировочную характеристику.

Вводят равные объемы пробы и исходных растворов (см. 4.12.3 и 4.12.4) или компенсируют различие, применяя соответствующий коэффициент при расчетах результатов. Проверяют линейность градуировочной характеристики, используя минимальное из трех значений уровней разбавления исходного раствора -каротина (см. 4.12.1).

7.5 Количество определений

Проводят не менее двух независимых определений.

     8 Обработка результатов

Вычисления основываются либо на градуировочной характеристике, либо их проводят с использованием программ интегратора или по следующей упрощенной процедуре.

Массовую долю общего каротина в пробе , мг/100 г, вычисляют по формуле

,                                         (2)

где - площадь или высота пика для изомеров -каротина, полученного в растворе испытуемой пробы (см. 7.2.4), единицы площади или высоты;

- массовая концентрация -каротина в стандартном растворе, скорректированная на чистоту (см. 4.12.2), мкг/см;

- объем раствора анализируемой пробы (см. 7.2.4), см;

- объем введенного стандартного раствора,  мм;

- площадь или высота пика для -каротина, полученного в стандартном растворе (см. 4.12.3), единицы площади или высоты;

- масса пробы, г;

- объем введенного раствора испытуемой пробы, мм;

1000 - коэффициент для перевода из мкг в мг;

100 - коэффициент для вычисления массовой доли в пересчете на 100 г.

     9 Прецизионность

Подробная информация о межлабораторном испытании прецизионности данного метода по [12] приведена в приложении В. Значения, полученные в ходе этого исследования, могут оказаться неприменимыми к диапазонам содержания компонентов и матрицам проб, отличным от указанных в приложении В.

9.1 Повторяемость

Абсолютная разность между результатами двух отдельных испытаний, полученных на идентичном исследуемом материале одним оператором на одном и том же оборудовании за минимально возможный промежуток времени, превысит предел повторяемости не более чем в 5% случаев.

Значения для общего -каротина:

9.2 Воспроизводимость

Абсолютная разность между результатами двух отдельных испытаний, полученных на идентичном исследуемом материале в двух лабораториях, превысит предел воспроизводимости не более чем в 5% случаев.

Значения для общего -каротина:

     10 Протокол испытаний

Протокол испытаний должен содержать следующую информацию:

- информацию, необходимую для идентификации пробы;

- ссылку на настоящий стандарт или на использованный метод;

- результаты и единицы, в которых выражены результаты;

- дату и тип процедуры отбора пробы (если известны);

- дату поступления пробы;

- дату проведения испытаний;

- любые особенности, наблюдавшиеся при проведении испытаний;

- любые операции, не указанные в данном методе или считающиеся необязательными, которые могут повлиять на результаты испытаний.

Приложение А
(справочное)

     
Пример хроматограммы

А.1 Пример хроматограммы приведен на рисунке А.1.

а) поглощение

b) время

Рисунок А.1 - Пример хроматографического разделения и -каротинов и ликопина в пробе овощной смеси

Неподвижная фаза: Spherisorb®5ODS2 м, картридж 100х4,6 мм, комбинированный с Vydac® 201ТР54, 5 мкм, 250х4,6 мм.

_______________

Spherisorb® - торговое название продукции, поставляемой PhaseSeparationsInc; Vydac® - торговое название продукции, поставляемой TheSeparationsGroup. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является рекламированием названной продукции. Могут использоваться аналогичные изделия, если они дают аналогичные результаты.

Подвижная фаза: Ацетонитрил/метанольный раствор ацетата аммония/дихлорметан (в объемном соотношении 75:20:5) с массовой долей бутилгидрокситолуола 0,1% и триэтиламина 0,05%.

Скорость потока: 1,5 см/мин.

Объем вводимой пробы: 50 мм. Детектирование: 450 нм.

Приложение В
(справочное)

     
Данные о прецизионности

Статистические результаты и данные о прецизионности, указанные в таблице В.1 для определения общего -каротина, были установлены в межлабораторном испытании [12], организованном W. Schuep и J. Schierte [11].

Таблица В.1

Данные о валидации, представленные в таблице В.2, были получены в ходе сравнительных испытаний, которые проводились в рамках программы по измерению общего -каротина в пробе овощной смеси, организованной Европейской комиссией по стандартизации, измерениям и испытаниям, Институтом исследования пищевых продуктов, г.Норвич, Великобритания в 1996 году [10].

Таблица В.2

 Приложение С
(справочное)

     
Альтернативные варианты условий хроматографического анализа

Идентификация и количественное определение дали удовлетворительные результаты при использовании хроматографических условий в таблице С.1 [10], а также в [11].

Таблица С.1

Приложение ДА
(справочное)

Сведения о соответствии ссылочных международных и европейских стандартов межгосударственным стандартам

Таблица ДА.1

Библиография